Поместить - 1) определить место для чего-либо (положить, поставить, повесить, расположить), 2) поселить, предоставить помещение для жилья, 3) устроить кого-либо куда-либо (в больницу, в детский дом, в интернат), 4) вложить средства (деньги), 5) напечатать, опубликовать.
Примеры употребления: поместить кресло в углу, поместить гостей в угловую комнату, меня поместили в хирургическое отделение, поместить деньги в коммерческий банк под проценты, в последнем номере журнала «Новый мир» за 2013 год поместили подборку стихов известного поэта.
Разместить - 1) расположить в определённом порядке, 2) распределить между многими лицами (участниками).
Примеры употребления: разместить посуду на полке, разместить бельё в шкафу, выгодно разместить заказы.
Уместить - поместить что-либо полностью или в большом количестве.
Примеры употребления: мама смогла уместить все мои вещи на одной полке, хочу уместить все яблоки в одну корзину.

Поместить(ся) - разместить(ся) - уместить(ся)

Поместиться - 1) уместиться, найти достаточно места, 2) поселиться.
Примеры употребления: не думал, что здесь может поместиться столько народу; крупа не помещается в банку; мы поместились в небольшом домике на берегу.

Разместиться - найти для себя место, расположиться, устроиться.
Примеры употребления: разместиться в доме, в комнате, в кресле, на диване, удобно разместиться.

Уместиться - 1) поместиться полностью, 2) расположиться, устроиться на ограниченном пространстве.
Примеры употребления: сёстры уместились на одном стуле; не думал, что в такой маленькой комнате может уместиться столько народу.

Поместный -1) относящийся к поместью, 2) владеющий поместьем.
Примеры употребления: поместное землевладение, поместное дворянство.

Помещичий - принадлежащий помещику.
Примеры употребления: помещичий дом, помещичья усадьба, помещичий сад, помещичья конюшня .

Пополнить - увеличить, прибавить, сделать более полным.
Примеры употребления: пополнить счёт в банке, пополнить запасы продовольствия, пополнить коллекцию.
Заполнить - 1) занять целиком, наполнить, 2) вписать требуемые сведения.
Примеры употребления: вода прибывала: она быстро заполнила подвалы домов; заполнить анкету, бланк, форму заявления.

Постареть - стать старше или старее.
Примеры употребления: отец, дед, брат, сват постарел, мать постарела, кошка постарела.
Устареть - 1) стать старым, 2) выйти из употребления, из моды, из обихода.
Примеры употребления: мои взгляды устарели, пора их менять; классика не может устареть; методы исследования устарели; оборудование устарело.

Поступок - намеренное действие.
Примеры употребления: благородный поступок, самоотверженный поступок, мужской поступок, достойный поступок, совершить поступок.
Проступок - поступок, нарушающий правила поведения; провинность.
Примеры употребления: допустить проступок, досадный проступок, серьёзное наказание за проступок.

Почтенный - 1) достойный почтения, уважения, 2) значительный (о расстоянии или размере, объёме).
Примеры употребления: почтенный господин, старик; почтенные цели, задачи; находиться на почтенном расстоянии.
Почтительный - 1) относящийся к кому-либо с почтением или демонстрирующий почтение, уважение, 2) значительный (о расстоянии или размере, объёме).
Примеры употребления: почтительный молодой человек, почтительный вид, почтительные манеры, почтительное выражение лица, почтительный взгляд; на почтительном расстоянии.

Праздничный - 1) относящийся к празднику, 2) нарядный, красивый, 3)торжественно-радостный, счастливый.
Примеры употребления: праздничная дата, праздничное событие, праздничный салют; праздничный наряд, костюм; праздничное платье; праздничный вид, праздничное настроение, праздничные воспоминания.

Праздный - 1) ничем не занимающийся, находящийся без дела, 2) не заполненный работой, делом, 3) пустой, бесполезный, бесцельный, порождённый бездельем.
Примеры употребления: праздный и пустой человек, никто не видел его праздным; праздная жизнь, праздный образ жизни, праздный разговор, праздный вопрос, праздный интерес.

Практический - 1) относящийся к практике, 2) занимающийся каким-либо делом непосредственно, лично, 3) являющийся применением знаний и умений на практике.
Примеры употребления: практическая деятельность, практическое применение, практическое значение; практическое руководство, практический центр; практические занятия, практические знания и умения, практические приёмы.

Практичный - 1) разбирающийся в практических делах, успешный в практической стороне жизни, 2) выгодный, удобный.
Примеры употребления: практичный человек; практичная хозяйка, жена, мать; практичный шаг; практичный цвет, материал.

Предоставить - 1)дать возможность пользоваться или владеть чем-либо, 2) дать возможность или право делать что-то.
Примеры употребления: предоставить возможности, предоставить документы, предоставить свободу выбора, право; предоставьте мне самой решать, предоставить управление имением новому человеку.

Представить - 1)дать для ознакомления, 2) выделить, послать в качестве представителя, 3) ходатайствовать о награде, повышении в чине, должности, 4) познакомить, отрекомендовать, 5) показать, продемонстрировать, 6) изобразить на сцене, сыграть, 7) мысленно вообразить.
Примеры употребления: представить результаты исследования; представить кандидатов от области, от школы; представить к награде; представить жениха родителям; представить перспективы, направление работы; актёры удачно представили чувства и состояния своих героев; представить себе что-либо, представлять интерес.

Представительный - 1) выборной, 2) отражающий интересы всех заинтересованных лиц, групп, сторон, 3) солидный, видный, производящий благоприятное впечатление.
Примеры употребления: представительная власть, представительные органы власти; представительное собрание, представительный съезд, представительная выставка; представительный мужчина, представительная внешность.

Представительский - 1)для цели представления, 2) класс уровня люкс.
Примеры употребления: представительские расходы, цели; представительские интересы; автомобиль представительского класса, номер (в отеле) представительского класса.

Представление - 1) сущ. от глагола представлять, 2) официальная бумага, ходатайство о награде, повышении в должности, чине, 3) спектакль, театрализованное действие, 4) образ предметов и мира в восприятии людей, 5) понимание, знание.
Примеры употребления: представление доказательств в суде; представление к награде; театрализованное представление; мои представления, ваше представление, получить представление о событиях; иметь самое общее представление об исторических процессах.

Предоставление - сущ. от глагола предоставлять: обеспечение.
Примеры употребления: предоставление жилой площади, предоставление услуг, предоставление возможностей, предоставление работы в соответствии с контрактом.

Признанный - 1) тот, кого признали (причастие от гла. признать), 2) оцененный по достоинству, известный.
Примеры употребления: признанный авторитет, признанный талант; признанный художник, актёр, режиссёр, общественный деятель, учёный.

Признательный - испытывающий или выражающий признательность, благодарность.
Примеры употребления: быть признательным, признательные слова, признательное отношение.

Принизить - 1) поставить у унизительное положение, унизить, 2) умалить значение, недооценить.
Примеры употребления: принизить в собственных глазах, принизить значение, принизить роль.

Унизить - задеть, оскорбить.
Примеры употребления: унизить перед всеми; унизить отношением, словами, пощёчиной, криком.

Проблематический - предположительный, недосказанный, маловероятный, сомнительный.
Примеры употребления: проблематичное решение, утверждение, заключение, предположение; проблематичный вывод, итог; проблематичная возможность.

Проблемный - содержащий проблему или предназначенный для ее разрешения.
Примеры употребления: проблемная ситуация, проблемная статья, проблемная группа, проблемный подход, проблемный урок, проблемная лекция.

Производственный - относящийся к производству или предназначенный для производства.
Примеры употребления: производственный процесс, производственные мощности, производственный отдел, производственные отношения, производственный брак, производственное совещание, производственная территория.

Производительный - производящий, создающий, продуктивный.
Примеры употребления: производительный труд, производительные силы.

Пророчить - предсказывать, предвещать.
Примеры употребления: пророчить будущее; пророчить несчастье, неприятности; пророчить удачу, победу.

Прочить - предназначать, предрекать.
Примеры употребления: прочить в жёны, в мужья; прочить в начальники; прочить в невесты; прочить за себя, за брата.

Рыболов - 1) тот, кто ловит рыбу, 2) любитель рыбной ловли.
Примеры употребления: По берегам озерка сидели и стояли рыболовы. Страстный рыболов, рыболов-любитель; настоящий, знающий, бывалый рыболов.

Рыбак - 1) тот, кто занимается рыболовецким промыслом, 2) Любитель рыбной ловли (разг.)
Примеры употребления: рыбаки работали бригадой; бригада рыбаков; настоящий, хороший, старый рыбак.

Рыболовный - относящийся к рыбной ловли или предназначенный для рыбной ловли.
Примеры употребления: рыболовный сезон, рыболовная снасть, рыболовный тральщик, рыболовный флот.

Рыболовецкий - занимающийся рыбной ловлей как промыслом.
Примеры употребления: рыболовецкая артель, рыболовецкий траулер.

Словарный - относящийся к словарю или работе по созданию словарей.
Примеры употребления: словарная статья, словарный состав языка, словарная работа.

Словесный -1)прилагательное от сущ. слово, 2) выражаемый словами, в словах.
Примеры употребления: словесная война, баталия; словесный материал, словесные сочетания.

Сопротивление - 1) противодействие, 2) термин: сопротивление материалов
Примеры употребления: сопротивление властям, сопротивление воле родителей, электрическое сопротивление, сопротивление сжатию, сопротивление материалов; сопротивление воздуха.

Сопротивляемость - способность сопротивляться.
Примеры употребления: сопротивляемость болезням, инфекциям, стессу; сопротивляемость организма; сопротивляемость горных пород выветриванию.

Сравнимый - причастие от глагола сравнить; тот, который может сравниваться с чем-либо.
Примеры употребления: сравнимые величины, ни с чем не сравнимый.
Сравнительный - 1) основанный на сравнении, 2) относительный, 3) лингвистический термин: сравнительная степень, сравнительное прилагательное, сравнительное наречие.
Примеры употребления: сравнительный метод исследования, сравнительное языкознание; сравнительная тишина, сравнительный достаток; сравнительное прилагательное, сравнительная степень.

Старинный - 1) созданный в старину, 2) давний, старый
Примеры употребления: старинный ковёр, старинная монета, старинное украшение, старинные книги; старинное знакомство, старинный друг.
Старый -1) проживший много лет, 2) давний, старый, 3) давно находящийся в употреблении, 4) (о времени) минувшее, 5) бывший ранее.
Примеры употребления: старый дед, старая женщина; старая обида, старая рана, старая боль, старая традиция; старое платье, старая обувь, старый дом; старое время, старое житьё; старый адрес, телефон, старые данные.

Стеклянный - 1) сделанный из стекла, 2) такой, как стекло, 3) неподвижный, безжизненный.
Примеры употребления: стеклянный стакан, стеклянная посуда; стеклянный блеск, стеклянный звон; стеклянный взгляд, стеклянные глаза.

Стекольный - предназначенный для стекла или изготовления стекла, работы со стеклом.
Примеры употребления: купить стекольную замазку; стекольная мастерская, стекольный завод, стекольное сырьё, стекольная промышленность.

Сытный - 1) хорошо насыщающий, калорийный, 2) обильный.
Примеры употребления: сытные пироги, сытное блюдо; сытный обед, сытный корм; сытная жизнь, сытная зимовка.

Сытый - 1) не испытывающий голода, 2) упитанный, откормленный, 3) живущий в достатке.
Примеры употребления: сытый человек, сытые дети, сытый кот, сытый скот; сытая страна, сытая Европа.

Удачливый - тот, кому способствует удача; успешный.
Примеры употребления: удачливый предприниматель, удачливый спортсмен; удачливая охота.

Удачный - 1) завершившийся успехом, удачей, 2)хороший, отвечающий требованиям.
Примеры употребления: удачное дело, удачная операция; удачный фильм, спектакль, удачная роль, удачные слова.

Упоминание - слова, касающиеся кого-то, сказанные не специально, а вскользь.
Примеры употребления: упоминание об актёре, упоминание кстати, уместное упоминание, упоминания в прессе.

Напоминание - слова, с целью напомнить.
Примеры употребления: важное напоминания, напоминание о договоренности, напоминание об уговоре, напоминание о себе, напоминание о дне рождения, напоминание в компьютере.

Поместить

Поместить

ПОМЕСТИ́ТЬ

помещу́, помести́шь (поме́стишь простореч.), сов. (к помещать).

1. кого–что . Предоставить место кому–чему–н., дать расположиться где–н. Поместить гостя на диване. Поместить туристов в гостинице .

2. кого–что . Поставить, расположить, уложить. Я поместил источник света позади. Все книги можно поместить в шкафу. Поместить хор в глубине сцены .

3. кого–что . Определить, пристроить, отдать куда–н. (устар.). «Старик Аратов поселился в столице с целью поместить сына в университет.» Тургенев . «Дядя–опекун в Петербург его привез, на службу его поместил.» Тургенев .

4. что . Распорядиться чем–н., определить место, назначение для чего–н. Поместить где–н. капитал. Поместить свои сбережения в сберкассу. Поместить где–н. заказы .

5. что . Передать для публикации, напечатания. Поместить статью в журнале. Поместить объявление в газете .

Толковый словарь Ушакова . Д.Н. Ушаков. 1935-1940 .

Смотреть что такое "поместить" в других словарях:

Вместить, уместить, втиснуть, уложить; поселить, вселить, водворить, разместить; пристроить, примостить, приткнуть, закатить, взгромоздить, впихнуть, впихать, подложить, переместить, выложить, запихать, дислоцировать, заложить, нагрузить, сунуть … Словарь синонимов

ПОМЕСТИТЬ, поместье и пр. см. помещать. Толковый словарь Даля. В.И. Даль. 1863 1866 … Толковый словарь Даля

ПОМЕСТИТЬ, ещу, естишь; ещённый (ён, ена); совер. 1. что. Определить, найти место для чего н. П. книги на полку. 2. кого (что). Поселить (в каком н. помещении, жилье). П. приезжего в отдельный номер. 3. кого (что). Отдать куда н. для какой н.… … Толковый словарь Ожегова

поместить - поместить, помещу, поместит (неправильно поместит) … Словарь трудностей произношения и ударения в современном русском языке

поместить - что л. куда и где. 1. куда (определить, устроить куда л.; отдать для хранения, использования). Поместить ребенка в детский сад. Поместить деньги в сберегательную кассу. [Отец] повез его в Петербург, как только ему минул восемнадцатый год, и… … Словарь управления

поместить - ПОМЕЩАТЬ/ПОМЕСТИТЬ ПОМЕЩАТЬ/ПОМЕСТИТЬ, располагать/ расположить, устраивать/устроить, разг., сов. деть, разг., несов. и сов. девать, разг. пристраивать/пристроить … Словарь-тезаурус синонимов русской речи

I сов. см. помещаться 1., 2., 3., 4. II сов. перех. см. помещать Толковый словарь Ефремовой. Т. Ф. Ефремова. 2000 … Современный толковый словарь русского языка Ефремовой

Поместить, помещу, поместим, поместишь, поместите, поместит, поместят, поместя, поместил, поместила, поместило, поместили, помести, поместите, поместивший, поместившая, поместившее, поместившие, поместившего, поместившей, поместившего,… … Формы слов

Глаг., св., употр. сравн. часто Морфология: я помещу, ты поместишь и поместишь, он/она/оно поместит и поместит, мы поместим и поместим, вы поместите и поместите, они поместят и поместят, помести, поместите, поместил, поместила, поместило,… … Толковый словарь Дмитриева

Книги

• Вырезаем снежинки , Серова Виктория Викторовна, Серов Владимир Юрьевич. Бумажные снежинки... В чьем детстве не было этого маленького волшебства складываешь квадратик, вырезаешь, разворачиваешь, затаив дыхание, и вот оно чудо рукотворная снежинка! Удивительное…

Огромное количество биологических исследований начинается с одного простого действия - в клетку вносится чужеродный генетический материал. Это действие называется молекулярным клонированием . С его помощью можно получить генетически модифицированные организмы, включить и выключить отдельные гены, определить влияние какого-нибудь белка на какой-нибудь сложный процесс и так далее. Можно сказать, что молекулярное клонирование - это краеугольный камень, основа основ, фундамент, без которого множество замечательных методик было бы неосуществимо.

Однако поместить в клетку «неродную» ДНК не так просто, как кажется на первый взгляд. Это длинный, трудоемкий и многоэтапный процесс. Молекулярному клонированию посвящены целые книги, и, к сожалению, в статье, даже очень большой, невозможно осветить все его тонкости и нюансы - что-нибудь обязательно останется за бортом. Тем не менее я попробую хотя бы немного рассказать о том, что это такое и что нужно для того, чтобы это получилось.

Вставка

Раз мы собираемся вставлять в клетки какой-то ген, то самый первый, очевидный, шаг, который нам нужно сделать, - этот ген как-нибудь получить, причем желательно в больших количествах (поскольку - увы! - все методики несовершенны, и нам надо приготовиться к тому, что бо льшая часть копий этого гена бесследно пропадет по дороге и так и не достигнет цели).

Чужеродный ген, вносимый в клетку, называется геном-вставкой или просто вставкой (см. Insert). Получить его можно несколькими способами.

Во-первых, мы можем просто выделить его из того генома, к которому он принадлежит. Допустим для простоты, что наша вставка - это какой-нибудь ген слона. Тогда нам нужно:

1. Получить образец тканей слона.
2. Извлечь из этого образца ДНК (см. DNA extraction).
3. Вычленить из этой ДНК интересующий нас ген и получить его в больших количествах (для этого используется ПЦР). [Заметим в скобках, что получение гена с помощью ПЦР возможно, только если мы знаем его нуклеотидную последовательность или хотя бы последовательность его начала и окончания (для того, чтобы можно было синтезировать праймеры). Если же всё это нам неизвестно, то придется сначала анализировать слоновий геном].

Во-вторых, вполне возможно, что нужный нам ген уже был выделен из генома слона и присутствует в библиотеке генов . Тогда нашу вставку можно будет получить оттуда (с этим, на самом деле, тоже придется повозиться, но меньше, чем в первом случае).

И наконец, в-третьих, не обязательно использовать в качестве вставки уже существующий ген. Если исследователь собирается работать с каким-нибудь геном, который является плодом его фантазии и не встречается в природе, то он может синтезировать его искусственно (см. Artificial gene synthesis).

Вектор

Запускание в клетку «одинокой» вставки, то есть гена самого по себе, безо всякого сопровождения, - дело совершенно бесперспективное. В клетке плавает множество расщепляющих ДНК ферментов (нуклеаз), которые с радостью набросятся на нашу беззащитную вставку и разрежут ее на кусочки. В результате вставка бесславно исчезнет, не успев совершить ничего полезного, а клонирование не приведет ни к каким результатам.

Поэтому, чтобы защитить вставку, ее встраивают в специальное «транспортное средство», которое называется вектором . В самом элементарном случае вектор - это просто последовательность ДНК, в которую вшивается наша вставка и которая помогает ей не пропасть в клетке и выполнить свое предназначение.

Существует несколько видов векторов, но среди исследователей самой большой (и заслуженной) любовью пользуется один из них - плазмиды . С них-то мы и начнем.

Плазмида

Плазмида - это довольно короткая и обычно кольцевая молекула ДНК, которая плавает в цитоплазме бактериальной клетки. Плазмиды не связаны с бактериальной хромосомой, они могут реплицироваться независимо от нее, могут «выплевываться» бактерией в окружающую среду или, наоборот, из этой окружающей среды «проглатываться». С помощью плазмид бактерии обмениваются друг с другом генетической информацией, например передают соседям устойчивость к какому-нибудь антибиотику.

Плазмиды существуют в бактериях в естественных условиях. Но никто не может помешать исследователю искусственно синтезировать плазмиду, которая будет обладать нужными для него свойствами, вшить в нее вставку и запустить в клетку. Плазмида - это, можно сказать, заготовка, болванка; в одну и ту же плазмиду можно вшивать разные вставки. Поэтому плазмиды стараются сделать как можно более универсальными и подходящими для всех случаев жизни.

Для того чтобы из плазмиды получился рабочий вектор, она должна обладать некоторыми важными характеристиками.

Размножение

Прежде всего, плазмида обязательно должна в клетке размножаться, реплицироваться, потому что иначе она быстро подвергнется деградации, а вместе с ней исчезнет и ген-вставка. Для этого в ней должна быть специальная последовательность под названием точка начала репликации , с которой и начинается удвоение ДНК. У разных видов живых существ эти точки имеют разную нуклеотидную последовательность. Поэтому если мы хотим создать плазмиду, которая бы реплицировалась сразу в двух видах клеток (например, и в дрожжевых, и в бактериальных), то нам надо вставить в нее две точки начала репликации.

Разрезание

Кроме того, в ДНК плазмиды должны быть участки, в которых ее можно будет разрезать, чтобы вшить туда вставку. В качестве «ножниц» используются особые ферменты под названием рестриктазы . Рестриктазы прекрасны тем, что режут ДНК не где попало, а в строго определенных местах, которые называются сайтами рестрикции (каждая рестриктаза распознает только свой сайт и только в нём - или возле него - разрезает ДНК). Обычно в плазмиду ставят множество разных сайтов рестрикции, расположенных в разных точках, - благодаря этому ее можно будет разрезать в нужном месте нужной рестриктазой. Участок ДНК, на котором собрано несколько сайтов рестрикции, называется полилинкером (см. Multiple cloning site).

Селекция

Процесс, при котором бактерия глотает плазмиду, именуется трансформацией . В естественных условиях в каждый момент времени трансформироваться может не вся популяция бактерий, а только ее часть; клетки, которые к этому способны, называются компетентными (см. Competence). Существуют лабораторные методы, с помощью которых можно искусственно увеличить количество компетентных клеток (некоторые из них описаны ниже в главе «Как поместить вектор в клетки»), однако всё равно стопроцентная компетентность для бактериальной культуры - вещь недостижимая.

Так что, добавляя плазмиду к бактериям, мы заранее смиряемся с тем, что бо льшая часть бактериальных клеток так и останется бесплазмидной, нетрансформированной. Поэтому нам придется отделять зерна от плевел, то есть трансформированные клетки от всех остальных. Для этого используется простой, но остроумный прием.

Допустим, мы встроили в нашу плазмиду ген устойчивости к какому-нибудь антибиотику (такой ген называется селективным маркером , см. Selectable marker). Теперь клетки, которые «съели» плазмиду, будут неуязвимы для этого антибиотика и смогут спокойно жить в его присутствии. В результате, чтобы выделить из всех бактерий, к которым мы добавили плазмиду, те, которые смогли эту плазмиду использовать по назначению, нам достаточно будет добавить к бактериальной культуре соответствующий антибиотик. Те клетки, которые нам нужны, смогут существовать и делиться в присутствии этого антибиотика, а остальные этого делать не смогут.

Но это - только начало селекции. Дело в том, что когда мы вшиваем в плазмиду вставку, то помимо желаемого сочетания (вставка внутри плазмиды) возникает множество побочных продуктов (см. ниже). Поэтому, если клетки устойчивы к антибиотику, это еще не говорит о том, что в них «сидит» нужный нам вектор. Вполне возможно, что они съели просто пустую плазмиду, от которой нам не будет никакого проку.

Поэтому нам нужно провести еще один этап селекции, а для этого в плазмиде должен быть еще один селективный маркер. Это может быть, например, ген устойчивости к какому-нибудь другому антибиотику. Тонкость тут в том, что наш сайт рестрикции будет расположен посередине этого гена. Если плазмида пустая, без вставки, то этот ген будет рабочим, и устойчивость к антибиотику сохранится. Если же в середину этого гена ухитрилась вклиниться вставка, то ген будет испорчен, устойчивость к антибиотику нарушится, и рост бактерий в его присутствии будет угнетаться. То есть всё, что нам нужно сделать после первого этапа селекции, - просто перенести наши клетки на среду с антибиотиком для второго селективного маркера и в этот раз выбрать те колонии, которые не растут.

Существуют и другие способы провести селекцию. Можно, например, поместить сайт рестрикции не внутрь гена антибиотика, а внутрь какого-нибудь «заметного» гена (скажем, такого, в присутствии которого бактериальные культуры меняют цвет). В результате можно будет отличить нужные колонии от ненужных просто на глаз, безо всяких манипуляций. По такому принципу работает, например, очень модная сейчас система бело-голубой селекции (см. Blue white screen).

В принципе, можно обойтись и без второго этапа селекции, а просто проанализировать (например, с помощью ПЦР или электрофореза) плазмидный состав нескольких бактериальных клонов и выбрать тот клон, в котором «сидит» плазмида с геном-вставкой.

Если мы собираемся работать только на бактериях, то всем вышесказанным дело и ограничится. Однако если конечная наша цель - поместить вектор в какие-нибудь другие, эукариотические, клетки, например клетки млекопитающих, то нам предстоит еще один этап селекции.

Дело в том, что в большинстве эукариотических клеток плазмиды живут недолго и быстро подвергаются деградации. Поэтому, даже если мы заставили клетку «съесть» плазмиду, не стоит питать надежды на то, что наша вставка теперь останется в этой клетке навсегда. Скорее всего, она успеет только немного поэкспрессироваться, прежде чем содержащий ее вектор будет пойман нуклеазой и разрезан на кусочки. Однако если вектор случайно смог встроиться в геном (это событие очень редкое, но не невероятное), то наша вставка, можно сказать, пустит в этой клетке корни - причем не только в этой клетке, но и во всех ее потомках. И для того, чтобы выделить из всех клеток те, которые имеют вектор в своем геноме, нам понадобится еще один селективный маркер - ген устойчивости к какому-нибудь эукариотическому антибиотику (потому что бактериальные антибиотики, как правило, на клетки эукариот не действуют). Добавив соответствующий антибиотик (например, генетицин, см. G418) к среде, в которой культивируются клетки, мы через некоторое время получим популяцию только тех клеток, в геноме которых «сидит» наш вектор.

Кроме того, можно вставить в нашу плазмиду в качестве маркера еще и какой-нибудь ген, обладающий яркой индивидуальностью (скажем, ген зеленого флуоресцентного белка GFP). Этот белок светится под флуоресцентным микроскопом, и если клетка съела плазмиду, то она будет видна под микроскопом как светящееся пятно. А в бесплазмидных клетках никакого свечения наблюдаться не будет.

Промоторы, энхансеры, сайленсеры

Перед каждым рабочим геном находится короткий участок ДНК под названием промотор . Именно сюда прикрепляется фермент по имени РНК полимераза , который синтезирует РНК на матрице ДНК, что является первым и абсолютно необходимым этапом в экспрессии гена. Если у гена нет промотора, его экспрессию запустить невозможно, он так и остается молчащим, и хотя и присутствует в клетке, но никак себя не проявляет. Можно сказать, что ген без промотора - это всё равно что машина без педали газа. Поэтому в нашей плазмиде обязательно должен быть хотя бы один промоторный участок, под контроль которого можно будет поставить ген-вставку.

А промоторы бывают разные.

Во-первых, они различаются по своей силе. Некоторые вызывают бурную транскрипцию подконтрольного гена, другие - совсем вялую.

Во-вторых, у прокариот и эукариот промоторы отличаются. Прокариотические промоторы не работают в эукариотических клетках и наоборот. Поэтому будет Ужасной Ошибкой поставить тот ген, который должен, например, экспрессироваться в бактериальных клетках, под эукариотический промотор - это будет всё равно что оставить его без промотора вообще.

В-третьих, у эукариот есть несколько типов РНК-полимеразы - они обеспечивают синтез различных видов РНК. И каждый тип РНК-полимеразы распознает только свои промоторы и «не видит» чужие. Поэтому, в зависимости от того, какую именно РНК кодирует наша вставка (например, матричную или, наоборот, шпилечную, а может, и вовсе рибосомальную), нам нужно подбирать и тип промотора, который мы будем ставить в плазмиду.

И, наконец, в-четвертых, разные промоторы включаются по-разному. Некоторые активны постоянно. Другие активизируются только при определенных условиях - например, при повышении окружающей температуры или появлении в клетке каких-то веществ. К тому же, у многоклеточных организмов в каждой ткани включены одни промоторы и выключены другие. Можно, например, подобрать такой промотор, который будет активен только в нейронах. Или только в нейронах головного мозга. Или только в нейронах головного мозга, относящихся к одному из подкорковых ядер. Или только в крохотной субпопуляции нейронов головного мозга, относящейся к одному из подкорковых ядер. И сужать этот круг можно почти до бесконечности.

А еще у эукариот помимо промоторов есть другие регулирующие экспрессию гена участки ДНК - энхансеры (которые усиливают транскрипцию) и сайленсеры (которые ее ослабляют). Они, в отличие от промоторов, могут находиться не вблизи от подконтрольного гена, а на значительном от него удалении.

Знание всего этого дает исследователю удивительную свободу. Подобрав в плазмиду подходящий промотор (а если нужно, еще и какой-нибудь энхансер), он сможет творить с экспрессией гена-вставки почти всё, что ему заблагорассудится. Ну, скажем, сделать так, чтобы он экспрессировался сильно, только в мышечных клетках и только в ответ на повышение температуры.

Трансляция белка

Помещая вектор в клетку, ученый может хотеть двух разных вещей:

1. Чтобы происходила только транскрипция гена-вставки (то есть синтез РНК на матрице ДНК - например, этого достаточно, если в клетку вносится какая-нибудь некодирующая РНК).
2. Чтобы происходила и транскрипция, и трансляция гена-вставки (то есть экспрессия кодируемого вставкой белка).

В первом случае вектор называется транскрипционным , во втором - экспрессионным . Экспрессионные векторы обычно немного сложнее транскрипционных, потому что в них присутствуют:

1. Консенсусная последовательность Козак . Это длинное имя носит короткий (примерно в 10 нуклеотидов) фрагмент в самом начале молекулы матричной РНК, который через белки-посредники обеспечивает связывание этой мРНК с рибосомой (без чего, как нетрудно догадаться, синтез белка невозможен). Последовательность Козак характерна только для эукариот, причем у представителей разных видов она немного отличается. Поэтому, создавая экспрессионный вектор, надо вставлять в него последовательность, которая характерна именно для того живого существа, в клетки которого мы собираемся вставлять вектор. Кроме того, последовательность Козак бывает сильной и слабой - то есть приводящей к синтезу большого или малого количества белка. У прокариот роль последовательности Козак выполняет последовательность Шайна–Дальгарно , которая непосредственно (в смысле - без посредников, в отличие от последовательности Козак) соединяется с рибосомой, после чего и начинается синтез белка.
2. Последовательность Козак находится перед вставляемым геном. А после него должны находиться еще несколько коротких участков, к которым присоединяются белки, выполняющие полиаденилирование (см. Polyadenylation) - пришивание к концу свежесинтезированной РНК полиаденинового хвоста. Этот хвост выполняет несколько функций, в том числе обеспечивает экспорт РНК в цитоплазму и помогает организации трансляции - то есть, если мы хотим обеспечить синтез белка на основе нашей РНК, нам без него не обойтись.
3. И еще один момент. мРНК, которая служит матрицей для синтеза белка, может быть транскрибирована только и исключительно РНК-полимеразой II типа. Поэтому нам нужно вставить в плазмиду именно тот промотор, который работает с этой РНК-полимеразой.

Итак, мы подобрали все необходимые для плазмиды кусочки. Но мало просто соединить их вместе - огромную роль играет их взаимное расположение. Например, сайты рестрикции должны быть не только многочисленны и разнообразны, но и находиться в «правильных» местах. При этом надо стараться, чтобы итоговая плазмида была как можно компактней, поскольку, во-первых, так она будет стабильнее, а во-вторых, охотнее «проглотится» клеткой. Одним словом, вы уже, наверное, поняли, что дизайн хорошей плазмиды - это тонкое и филигранное искусство.

Плазмидные базы данных

За те несколько десятилетий, что существует методика молекулярного клонирования, были синтезированы тысячи разнообразных плазмид, из которых созданы гигантские базы данных (например, Addgene). В этих базах есть плазмиды на все случаи жизни - с разными типами точек начала репликации, разными полилинкерами, расположенными в разных местах, разными селективными маркерами и промоторами, и так далее. Есть те, в которые можно вшить не одну вставку, а несколько, и есть даже такие, которые уже несут в себе некоторые особенно популярные вставки. Поэтому, как правило, исследователи не синтезируют плазмиду для клонирования самостоятельно, а покупают уже готовую. При необходимости купленную плазмиду можно «довести до ума», вставив или убрав определенные участки (а потом эту модифицированную плазмиду тоже добавить в базу данных). Иными словами, часто задача ученого сводится просто к тому, чтобы подобрать подходящую плазмиду.

Другие векторы

Плазмида - прекрасный вектор для относительно небольших вставок. Если ген-вставка слишком велик, то плазмида утрачивает стабильность, потому что ее участки начинают «перетасовываться» друг с другом и теряться при репликации, из-за чего она постепенно укорачивается. Поэтому в качестве вектора для длинных вставок используются более устойчивые конструкции. Например:

• Космида (см. Cosmid) - гибрид плазмиды и фага (вируса, который заражает бактерии). По сути дела, это просто плазмида, в которую добавлены сайты для связывания с белками оболочки фага (они называются cos-сайтами, и именно благодаря им космиды получили свое название). Белковая оболочка делает космиду стабильнее, благодаря чему в нее можно загружать более длинные вставки.
• Искусственные хромосомы (см. Human artificial chromosome , Bacterial artificial chromosome , Yeast artificial chromosome) - это сложные и крупные конструкции, являющиеся, по сути, микрохромосомами (см. Microchromosome). Они относительно стабильные и при этом обладают гигантской емкостью, в них можно вставлять сразу несколько генов. Однако из-за огромных размеров их гораздо труднее поместить в клетку.
• И, наконец, есть еще один вид векторов - вирусные (см. Viral vector). Этот вид настолько важен, что ниже ему будет посвящен целый раздел.

Вставляем ген в плазмиду

Допустим, исследователь подобрал подходящую плазмиду и получил нужную вставку. Теперь нужно соединить одно с другим, чтобы затем засунуть в клетки.

Для этого достаточно совершить несколько простых действий.

Как уже говорилось, в плазмиде существует несколько сайтов рестрикции - то есть участков, в которых ее может разрезать нужная рестриктаза. Нам нужно выбрать подходящий сайт, который будет находиться в том месте, куда мы собираемся вшивать вставку, а затем обработать плазмиду соответствующей рестриктазой.

После этого той же рестриктазой нужно обработать вставку, поскольку рестриктазы обычно оставляют выступающие концы на одной из нитей ДНК, и эти концы должны быть совместимы у вставки и плазмиды, чтобы они «согласились» соединиться. Если на кончиках вставки нет нужных сайтов рестрикции, то можно приделать к нему короткие ДНК-фрагменты с нужными сайтами рестрикции на концах.

И наконец, нам нужно соединить в одной пробирке плазмиду и вставку (предварительно очищенные от рестриктаз) и добавить к ним специальный фермент под названием ДНК-лигаза (см. DNA ligase), который умеет лигировать (то есть сшивать воедино) две молекулы ДНК. Конечно, в результате мы получим не только желанный вектор, в котором плазмида соединена со вставкой (назовем его чеширским котом с улыбкой), но и целый коктейль побочных продуктов - пустую плазмиду (кота без улыбки), замкнутую вставку (улыбку без кота), несколько сшитых между собой вставок (много улыбок) и так далее. В ходе селекции эти ненужные продукты отсеются, и у нас в руках останется только вектор.

Выделяем вектор

Итак, вначале мы проводим селекцию.

1. Увеличиваем компетентность бактерий, добавляем к ним «коктейль», полученный в результате лигирования, а потом высеваем эти бактерии на среду с антибиотиком, который является нашим первым селективным маркером.
2. Выбираем те бактериальные клоны, которые растут на среде с антибиотиком - они смогли съесть плазмиду со вставкой или хотя бы просто плазмиду (кота - с улыбкой или без).
3. Проводим с этими клонами второй этап селекции, в зависимости от того, какой ген мы использовали в качестве второго селективного маркера. Например, если этот ген - устойчивость к другому антибиотику, то мы переносим бактерии на среду с этим антибиотиком и выбираем те клоны, рост которых угнетается, - они ухитрились проглотить не просто плазмиду, а плазмиду, в которую была вшита вставка (кота с улыбкой).
4. Выращиваем полученную культуру бактерий.

И вот мы получили ее - бактериальную культуру, в которой живет созданный нами вектор. Вполне возможно, что это и было нашей конечной целью, и теперь мы, спокойные и счастливые, можем, например, включить в бактериях экспрессию гена-вставки и пожинать урожай синтезированных в результате белков.

Но если нам нужен чистый вектор, который можно будет потом помещать в другие клетки, то у нас появляется проблема, которая кажется неразрешимой. Как вызволить вектор из бактерий? Ведь даже если мы выделим из этих бактерий ДНК, то помимо вектора получим еще и совершенно ненужную нам бактериальную хромосому.

Тут можно воспользоваться тем, что плазмидная ДНК имеет важные отличия от хромосомной: она, во-первых, гораздо меньше по размеру, а во-вторых, гораздо больше суперскручена (о том, что такое суперскрученность, см. DNA supercoil , или Сверхспирализация ДНК). Поэтому можно подобрать такие условия, в которых бактериальные хромосомы будут осаждаться, в то время как плазмиды останутся плавать в растворе. Достаточно будет отцентрифугировать получившийся осадок (чтобы вся бактериальная ДНК прочно «упала на дно»), а затем уже из надосадочной жидкости выделить нашу плазмиду (обычно для этого используются специальные колонки, которые очень облегчают и ускоряют работу).

Как поместить вектор в клетки

И вот наступил желанный миг. Исследователь держит в руке пробирку, в которой плещется прозрачная жидкость - столькими трудами полученный вектор.

И тут перед ним встает преграда. Клетки, в которые он собирается поместить свой вектор, отказываются его «глотать».

Дело в том, что липидная мембрана, которой окружены клетки, обладает избирательной проницаемостью - то есть она пропускает через себя одни частицы и не пропускает другие. Крупные заряженные молекулы (а именно таковой и является ДНК) через эту мембрану самопроизвольно пройти не могут. И если бактерии, например, умеют проглатывать плазмиды из внешней среды (как уже было сказано выше), то, скажем, клетки животных к этому совершенно не склонны. Поэтому для того, чтобы поместить в клетку вектор, исследователю приходится прибегать ко множеству хитростей, о которых и будет сейчас рассказано. Но сначала - немного терминов.

Для внесения в клетку вектора есть несколько обозначений в зависимости от того, какой используется вектор и в какие клетки он вносится.

AAV ведет себя настолько тихо,скромно и ненавязчиво, насколько этого вообще можно ждать от вируса. Практически единственное, что он делает, оказавшись в клетке, - это встраивается в хозяйский геном, причем почти всегда не в первое попавшееся, а в строго определенное место. Он, судя по имеющимся сейчас данным, не вызывает никаких заболеваний, поэтому и иммунный ответ на него очень слабый. К тому же, он способен заражать и делящиеся, и неделящиеся клетки. Одним словом, AAV - просто идеальная основа для вектора, хотя и он не лишен некоторых недостатков.

И главный его недостаток - малая емкость. В AAV-вектор могут «влезть» только совсем небольшие вставки, и в этом он очень проигрывает, например, лентивекторам.

Кроме того, AAV - дефективный, несамостоятельный вирус. Он может размножаться только в клетках, которые уже заражены аденовирусом (что и отражено в его названии). Это совсем неплохая черта, если мы хотим заразить нашим вектором культуру клеток; но если мы собираемся делать вектор для генной терапии (методики лечения генетических - и не только - заболеваний, при которой организм заражается вирусным вектором, несущим необходимые этому организму гены), то такая дефективность будет нам очень мешать, потому что вирусы не смогут как следует распространяться по организму. Однако сейчас эта проблема вроде бы решена, и разработаны AAV-векторы, которые способны размножаться сами по себе, безо всякой помощи.

Ну вот, допустим, подходящий вирус подобран. Теперь начинаются игры с его геномом.

1. Вначале нам нужно освободить в этом геноме место - то есть выкинуть из него какие-то гены. Обязательно нужно оставить те участки, на которые налипает оболочка (чтобы наш вектор был полноценным, «одетым» вирусом), и те гены, которые обеспечивают встраивание вирусного генома в геном хозяйской клетки (чтобы он мог выполнить свое предназначение); при этом от других областей - например, генов белков оболочки - мы можем с чистой совестью избавиться.

2. Из получившегося «огрызка» генома делается плазмида - вставляются фрагменты, о которых уже было рассказано выше (точки начала репликации, селективные маркеры и так далее). В принципе, такие плазмиды уже есть в плазмидных базах данных, и, как правило, задача исследователя сводится к тому, чтобы подобрать подходящую.

3. В эту плазмиду вшивается необходимая вставка (со всеми прелестями многоэтапной селекции, которые были описаны выше).

Теперь у нас возникает небольшая проблема. Даже поместив эту плазмиду в клетку, никаких вирусов мы не получим, потому что мы уже выкинули (в пункте 1) те гены, которые нужны для их создания. Поэтому нам придется пойти на маленькую хитрость.

Мы поместим в клетки не одну плазмиду, а две. Первая, основная (назовем ее Пу), - это та, которую мы получили в пункте 3. А вторая, вспомогательная (назовем ее Ме), будет нести гены, которые мы выкинули в пункте 1. Обе плазмиды начнут размножаться в хозяйской клетке. Плазмида Ме будет экспрессировать свои белки - например, белки оболочки и белки, необходимые для самосборки вирусов. Поскольку на Пу есть участки для налипания белков оболочки, то эти белки на нее и налипнут, и в результате мы получим вирус с необходимыми генами внутри, чего мы и добивались.

Итак, наш план действий таков:

4. Подбираем какие-нибудь клетки, которые хорошо поддаются трансфекции (такая линия клеток называется «упаковывающей»; обычно это линия эмбриональных клеток человеческой почки НЕК293, см. HEK cell) и помещаем в них сразу две плазмиды - Пу и Ме, основную и вспомогательную.

5. Ждем некоторое время (около двух дней), чтобы успели образоваться вирусы. После этого собираем среду, в которой живут клетки, - вирусы плавают в ней.

6. Очищаем полученные вирусы (как правило, для этого используется центрифугирование и фильтрация) и...

7. Используем их по назначению, то есть заражаем ту линию клеток, на которой собираемся проводить эксперименты.

Это, конечно, только общая схема, у каждого конкретного вектора есть свои нюансы. Например, бывает, что вместо одной вспомогательной плазмиды используют две или даже три. При создании некоторых AAV-векторов упаковывающие клетки нужно заразить аденовирусом. А если мы создаем вектор для генной терапии, который должен уметь размножаться в хозяйской клетке и заражать ее соседей, то нам придется гораздо аккуратнее обращаться с вирусным геномом и расчищать в нем место с большой осторожностью, чтобы не нарушить способность вирусов к самостоятельному размножению. И так далее.

Последний шаг

Итак - ура! - тем или иным способом мы всё-таки умудрились поместить вектор в клетки. Нам остается последний шаг - нужно выбрать из всех клеток те, которые встроили векторную ДНК в свой геном.

Собственно, для этого мы и добавили в вектор последний селективный маркер - ген устойчивости к антибиотику, работающему на эукариотических клетках. Мы просто будем постоянно добавлять этот антибиотик в среду, в которой находятся наши клетки, - в результате останутся в живых и смогут делиться только те, которые имеют в геноме этот ген и всю нашу векторную ДНК впридачу.

Всё! Клонирование завершено. Мы получили линию генетически модифицированных клеток, в геноме которых присутствует наша вставка. Пришло время проводить с этими клетками необходимые эксперименты.

Помест’ить , — ещу, — естишь; — ещённый (-ён, — ена); соверш. вид
1. что. Определить, найти место для чего-нибудь Поместить книги на полку.
2. кого (что). Поселить (в каком-нибудь помещении, жилье). Поместить приезжего в отдельный номер.
3. кого (что). Отдать куда-нибудь для какой-нибудь цели. Поместить ребёнка в детский сад. Поместить в больницу. Поместить сбережения в сберегательный банк.
4. что. Напечатать, опубликовать. Поместить статью в журнале. Поместить объявление в газете.
несовершенный вид помещать, — аю, — аешь.
существительное. помещение, — я, средний род

Примеры использования слова поместить в контексте

. Второй – у соседей наверху, Монастыревых, сейчас свободна комната, можно помести́ть Тату туда.
. - Ну, скажем ему, что я попал под экипаж или фургон и что меня пришлось помести́ть в лазарет.
. Я бы хотел помести́ть некоторые вещи в гостиничный сейф.
. Им пришлось в конце концов помести́ть Тома в сумасшедший дом.
. Ведь нельзя же, согласись, помести́ть всю свою привязанность в собаку.

При появлении 3d сканера первыми под раздачу попали соседи по офису. Сканировали их по всякому, не жалея. На фоне офисных тел, и бюстов с гримасами выделился руководитель небольшого коллектива – Василий Владимирович. Такой скан был приурочен к выходу нового макета. Требовались строители в разных тематических позах и, конечно же, прораб. Даже пришлось сбегать в строительный магазин за парой касок.

Солидная масса в 150 кг. при росте 180 см. сразу же определили в нем образ руководителя стройки. Густая борода покрывает 70% его сурового лица, а каска венчает мудрую, наполненную строительными нормативами и опытом, голову. Некоторая напряженность позы и взгляд из под козырька каски указывают на усталость и неудовлетворенность рабочими. Секунда и Василий продемонстрирует непереводимые обороты идиоматических выражений русского языка.

Процесс подготовки модели после сканирования достаточно творческий. Требует владения программой zbrush и чем выше уровень художественной подготовки автора, тем более живая получится модель. Учитывая масштаб уровень допиливания модели занял меньше часа.

3d модель оказалась востребована среди моделистов как образ тракториста, а не строителя. Один из авторов попросил распечатать его для диорамы «нудистский пляж». Не знаю зачем, жду фото.

Василий не вредный. Он и отсканировался с первой попытки и обработался быстро и распечатался и расписывать его было не трудно. В данном обзоре фото подарочного Василия. Адресатом подарка оказалась сама натура и несмотря на нелюбовь к миниатюре и моделизму, подарок порадовал.